基于测序空间转录组技术（sST）的快速发展改变了在空间背景下测量基因表达的能力，被Nature Methods评为2020年的年度技术^{[1, 2]}。这项技术是前沿生物研究关注的热点，有望从组织水平解析发育和疾病演进的规律，成为新的病理诊断工具。 近两年新技术不断涌现，然而技术发展应该关注哪些指标，如何对这些技术进行标准化的多维度评估和比较，尚无清晰的解决方案^[3]。sST通常涉及空间条形码的寡核苷酸，这些寡核苷酸以不同方式在微阵列、珠子、聚合物菌落 (polonies) 或纳米球上进行空间索引，或在微流控通道中进行空间索引。细胞释放的 mRNA 被局部捕获在每个位置中，这些位置包含具有相同空间条形码的寡核苷酸。斑点中心之间的距离经常作为重要的技术指标，被用作分辨率的衡量标准，然而其他的重要考虑因素，包括固定寡核苷酸捕获 mRNA 的效率以及分子扩散在细胞透化后 mRNA 在水平位置移动的情况在技术指标中常被忽视。

为了解决sST技术标准不清晰、评估方案混乱等问题，2024年7月4日，来自广州实验室和西湖大学的团队联合墨尔本大学、哈佛大学研究者在Nature Methods上发表了研究论文Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods。该研究对 11 种 sST 方法进行了全面比较（包括 10X Genomics Visium（基于 poly-A 和基于探针的两种方法）、DynaSpatial、HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq V2、Curio Seeker（Slide-seq 的商业版本）、Slide-tag、Stereo-seq、PIXEL-seq、Salus 和 DBiT-seq），使用具有明确形态的参考组织来评估它们的性能。研究建立了一套具有不同组织结构特征的标准参考组织，包括胚胎小鼠眼睛、成年小鼠海马区和嗅球；在进行统一的组织块制备和切片后，使用11种sST方法对这些组织进行了空间转录组学分析，生成了一个跨平台的数据集（称为cadasSTre），以便直接比较空间分辨率、分子捕获效率和分子扩散（图一）。

 图一. cadasSTre数据集的生成，和基准比对分析流程。
 

通过检查测序深度来评估分子捕获效率，研究使用每单位面积的总分子捕获数或将读数在样本间进行归一化的下采样。结果表明没有一种方法达到了测序饱和，因此所有方法都有提高灵敏度的空间，暗示空间组学可能需要比单细胞转录组更多的测序量。Stereo-seq和Slide-tag在使用所有测序数据时显示出更好的捕获效率，而Slide-seq V2、基于探针的Visium和DynaSpatial在相同的测序深度下表现出更好的捕获效率。有趣的是，在基于poly-A的Visium平台上观察到了一种意外的基因捕获偏差，能被其他技术一致检测到的高表达标志基因在Visium数据中未被找到。此外，研究发现分子扩散显著影响了不同方法和组织中的sST数据的有效分辨率。较高的扩散会导致信号变得更宽泛且不够清晰，从而降低分辨单个细胞的能力。为每种组织类型和方法优化透化条件至关重要，因为它可以最小化扩散并增强分辨率，使其更接近真实的单细胞水平。结果汇总见图二。

图二. 基准比对结果汇总。

通过使用单细胞RNA测序数据作为参考来评估空间转录组学技术的优缺点，研究观察到sST数据提供了单细胞数据之外的更多细节，例如捕获罕见的细胞状态模式，如在小鼠E12.5胚胎眼睛中发现的4种神经视网膜前体细胞亚群，这说明现阶段单纯使用单细胞数据作为参考来标注空间组学数据的分析模式可能存在缺陷（图三）。

图三. 各平台的胚胎眼数据聚类结果。已知的细胞类型和状态在左侧的示意图显示。在右侧，展示了聚类结果，用颜色编码的区域表示可识别的细胞状态。CM：角膜间质；pN：神经视网膜前体细胞；LV：晶状体囊泡。

同时，sST技术在下游细胞间通信分析中，被发现的配体受体对存在差异，这突显了谨慎选择平台的必要性以及开发更稳定的生信工具的重要性。

基准测试研究为生物学家在选择适宜的基于测序的空间转录组学（sST）平台时提供了指导，帮助他们在分辨率、灵敏度与分子扩散等多个关键因素间做出平衡。本研究是全球首个并且规模最大的空间组学技术的系统比较，建立了完整的评估方案，包括标准品的建立、实验流程、数据分析流程、具体指标等，且全部公开可重复。通过评估，不同技术方案各有优劣，一些国产技术平台的指标已经达到领先，凸显了中国在这一新兴领域的快速发展趋势。本研究为技术建立了底层标准，指引了技术开发方向，为空间组学这一新兴领域建立了“中国标准”。鉴于空间组学技术的发展速度，该比较研究将在网站上https://genographix.com/home持续更新，文章发表时已经更新了10X Visium HD的数据。接下来，团队将基于小鼠，以呼吸系统为切入点，建立人的空间组学标准品和技术评估方案。

广州实验室的田鲁亦与西湖大学的刘晓东为该研究的通讯作者，尤月与付宇婷为共同第一作者。该研究受到广州实验室、西湖大学教育基金会、国家自然科学基金以及科技部重点项目的支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02325-3 （上线日期 07/04 17:00）

参考文献：

1.Crosetto, N., Bienko, M. & Van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics 16, 57–66 (2015).
2. Marx, V. Method of the year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods 18, 9–14 (2021).
3. Tian, L., Chen, F. & Macosko, E. Z. The expanding vistas of spatial transcriptomics. Nature Biotechnology 41, 773–782 (2023).